Na czym polegają testy na koronawirusa SARS-Cov-2?

Na czym polegają testy na koronawirusa SARS-Cov-2?

Takiego kryzysu ludzkość dawno nie doświadczyła. Walczymy z niewidzialnym wrogiem, którego nie zdążyliśmy jeszcze dobrze poznać. Cały czas jest o krok przed nami i obnaża niedostatki w służbie zdrowia nawet bogatych krajów należących do G7. Koronawirus SARS-Cov-2 prawdopodobnie pojawił się już w listopadzie 2019 r. w chińskim Wuhan, został zidentyfikowany jednak dopiero około miesiąc później. A od lutego rozprzestrzenia się w zawrotnym tempie po całej Europie i powoduje chorobę o nazwie Covid-19 (and. Corona Virus Disease 19). 

Bardzo dużo mówi się o konieczności wykonywania jak największej liczby testów na obecność koronawirusa, ale zdecydowanie za mało tłumaczy się, jak one przebiegają. W tym wpisie wyjaśniam na czym polegają testy na SARS-Cov-2 i dlaczego tak długo trzeba czekać na wynik.

Spis treści
    Add a header to begin generating the table of contents

    Czym jest koronawirus SARS-Cov-2?

    Paraliżujący obecnie cały świat wirus należy do rodzaju beta-koronawirusów z rodziny Coronaviridae. Na koniec marca 2020 znamy siedem gatunków chorobotwórczych z tej rodziny, w tym SARS i MERS, które swego czasu wywołały epidemie na Bliskim Wschodzie i w Azji. Koronawirusy swoją budową przypominają koronę słoneczną, stąd ich nazwa. SARS-Cov-2 ma materiał genetyczny w postaci jednoniciowego RNA. Kwas nukleinowy przenoszący informację genetyczną zamknięty jest w zwykle kulistym kapsydzie, czyli płaszczu. Koronawirus składa się z czterech białek strukturalnych:

    Budowa SARS-Cov-2. CC BY-SA 4.0
    • S (ang. spike) – białko fuzyjne, odpowiedzialne za zdolność do zakażania komórek ludzkich
    • E (ang. envelope) – białko płaszcza, które odpowiada za formowanie wirionów (wirion to kompletna cząstka wirusa zdolna do zakażania komórek i przetrwania poza nią)
    • M (ang. membrane) – główne białko macierzy wirusa
    • N (ang. nucleocapsid) – białko ochronne dla materiału genetycznego RNA, uczestniczy w procesie modyfikacji procesów komórkowych i replikacji wirusów
    Białko S jest odpowiedzialne za łączenie się z błoną komórek gospodarza, umożliwiając zakażanie. Receptorem, do którego przejawia powinowactwo jest ACE 2, czyli konwertaza angiotensyny 2, która jest w znacznych ilościach obecna na komórkach nabłonka płuc, ale także jelit. 

    Genom koronawirusa liczy od 29 867 do 29 903 nukleotydów, a znanych jest już ponad 70 sekwencji wirusów wyizolowanych od różnych pacjentów. Zatem materiał do badań już jest i posłużył do konstrukcji testów genetycznych, o których ciągle słyszymy w mediach.

    Jak wygląda test na pandemicznego koronawirusa?

    Reakcja łańcuchowa polimerazy

    Diagnostyka w kierunku wykrycia zakażenia wirusem SARS-Cov-2 wykorzystuje dobrze znane metody analiz genetycznych opartych o reakcję łańcuchową polimerazy (ang. Polymerase Chain Reaction, PCR). To metoda opracowana przez Kary’ego Mullisa, za którą został nagrodzony Noblem. Sama reakcja jest bardzo prosta i wykorzystuje zasadę z jaką działa polimeraza DNA, czyli enzym, który powiela ten kwas nukleinowy. Enzym ten wymaga obecności na pojedynczej nici DNA krótkich fragmentów dwuniciowych. Rozpoznaje takie fragmenty, przyłącza się do nich i dalej powiela DNA. W PCR wykorzystuje się głównie polimerazę Taq, pochodzącą z bakterii Thermofilus aquaticus, która żyje w warunkach wysokiej temperatury. Polimeraza pracuje wydajnie w 72°C. Posiadamy technologię syntetyzowania krótkich (ok. 20 nukleotydów), jednoniciowych sekwencji DNA zwanych starterami (ang. primer). A dzięki znajomości sekwencji, którą chcemy powielić, potrafimy projektować startery, które będą się przyklejać do DNA w konkretnym miejscu, które chcemy badać. Szukamy w genomie sekwencji specyficznej, projektujemy parę starterów, które otaczają z dwóch stron ten fragment, po czym polimeraza go powiela. Ale żeby to wszystko zadziałało, musimy stworzyć odpowiednie warunki.

    Do PCR wykorzystuje się urządzenie zwane termocyklerem, które umożliwia szybkie zmiany temperatury. Znowu wykorzystujemy fizyczne właściwości DNA i polimerazy, a sama reakcja przebiega w wielokrotnie powtarzanych cyklach i odpowiedniej mieszaninie zawierającej matrycę DNA (materiał od pacjenta), mieszaninę nukleotydów, startery, polimerazę:

    1. Denaturacja – zwykle ok. 95°C przez ok. 10-15 sekund. W tej temperaturze podwójna nic DNA ulega rozpleceniu do pojedynczych nici
    2. Hybrydyzacja – z mojego doświadczenia zwykle 50 – 60°C. W tej temperaturze startery przyłączają się do specyficznych miejsc na jednoniciowej matrycy DNA, tworząc dwuniciowy fragment rozpoznawany przez polimerazę.
    3. Elongacja – 72°C, czas zależy od długości powielanego fragmentu i procesywności polimerazy, zwykle 1min/1000 nukleotydów. Na tym etapie polimeraza syntetyzuje na jednoniciowej matrycy dwuniciowy fragment DNA, który chcemy badać.
    Te cykle powtarza się zwykle 30 razy, a z jednej cząsteczki DNA po n cyklach uzyskujemy 2 do potęgi n cząsteczek. Istnieją modyfikacje tej metody, które pozwalają obserwować przyrost produktu PCR w czasie rzeczywistym (ang. quantitive PCR, qPCR). Wykorzystuje się do tego celu specjalne, fluorescencyjne barwniki lub sondy, które działają na zasadzie jest produkt – świeci, nie ma produktu – nie świeci. Tej technologii używa się w testach na koronawirusa.

    Ale zaraz, zaraz. Przecież pisałam wyżej o tym, że koronawirus ma materiał genetyczny w postaci RNA, a nie DNA. Jak to więc wygląda w przypadku SARS-Cov-2?

    Test molekularny na koronawirusa krok po kroku

    1. Z wymazu pobranego od pacjenta z podejrzeniem zakażenia izoluje się materiał genetyczny w postaci RNA. Gotowe zestawy są bardzo wydajne i ten proces może trwać nawet jedyne 30 min/próbkę. Przy dużej liczbie prób ten czas się wydłuża, ale niektóre laboratoria wykorzystują wydajniejsze od ludzi automaty. Na koniec trzeba z próbki wyeliminować DNA specjalnym enzymem DNazą.
    2. RNA jest bardzo niestabilne i wrażliwe na czynniki zewnętrzne, łatwo degraduje dlatego trzeba je przepisać na DNA. Do tego celu wykorzystuje się specjalny enzym znany z wirusów – odwrotną transkryptazę. Na matrycy RNA powstaje nić cDNA (ang. complementary DNA), która stanowi matrycę dla PCR.
    3. Trzeci, najdłuższy etap, to PCR. W teście specyficznym dla SARS-Cov-2 namnaża się trzy fragmenty materiału genetycznego wirusa, kontrolę dodatnią (to może być jakiś fragment ludzkiego genu lub sekwencja wirusowa dostarczona przez producenta; kontrola pozwala określić, czy reakcja zaszła prawidłowo) i kontrolę ujemną (brak matrycy DNA, prawidłowy wynik, to brak produktu PCR; pozwala określić, czy nie doszło do zanieczyszczenia prób). Reakcja w zależności od wykorzystanego termocyklera może trwać nawet 3,5 godziny. Sprzęty z różną wydajnością zmieniają temperaturę próby, jedne szybciej, inne wolniej.
    4. Analiza wyników. Diagnosta o odpowiedniej wiedzy analizuje wykres fluorescencji i na jego podstawie określa, czy wynik jest dodatni, czy ujemny. Żeby to określić, wykres porównuje z wynikiem kontroli dodatniej i kontroli ujemnej. To ważne, tylko punkt odniesienia pozwala stwierdzić, czy fragmenty wirusa uległy namnożeniu.
    Przykładowy wynik qPCR. Autor: Zuzanna K. Filutowska. Warunki licencji

    Same czynności laboratoryjne powinny zabrać ok. 5-6 godzin. Do oczekiwania należy jeszcze wliczyć czas na transport. A żeby wynik był miarodajny musi upłynąć jakiś czas. Szacuje się, że do 5 dni od zakażenia wynik może być fałszywie ujemny, dlatego w tym czasie nie ma sensu pobierać wymazu. Testy powinno się wykonywać od 7 dnia po kontakcie z nosicielem lub wcześniej, pod warunkiem, że wystąpiły objawy. Właśnie z tego względu tak ważna jest kwarantanna, a testów nie wykonuje się jak leci, tylko ze wskazań lekarza. Metoda jest skuteczna w ok. 60-70% lub 95-97% (Kanne i in. 2020) w zależności od państwa podającego statystyki i jest rekomendowana przez WHO jako najbardziej miarodajna w tej chwili.

    Inne metody diagnostyczne

    U osób, u których wystąpiły objawy Covid-19, najlepszą metodą diagnostyczną jest tomografia komputerowa klatki piersiowej. Zmiany w płucach, jakie koronawirus wywołuje są na tyle specyficzne, że na podstawie obrazowania można diagnozować z 98% dokładnością (Fang i in. 2020).

    Dużo mówi się o szybkich, przesiewowych testach immunologicznych. Polegają one na wykrywaniu przeciwciał IgM i IgG przeciw SARS-Cov-2. Problemem jest ich czułość. Ilość wyników fałszywie ujemnych sięga 70%, co w tej chwili sprawia, że są właściwie bezużyteczne. Za mało jeszcze wiadomo o odpowiedzi ludzkiego organizmu na zakażenie koronawirusem, żeby stosować szybkie testy immunologiczne. Co więcej, wykrywane są przeciwciała, a te po pierwsze pojawiają się w końcowej fazie infekcji, a po drugie utrzymują się jeszcze wiele tygodni po wyeliminowaniu zakażenia. Nie dają więc odpowiedzi, czy koronowirus w momencie wykonania testu jest obecny w organizmie. Mogą wskazywać na przebytą infekcję kilka tygodni wcześniej. Należy je potwierdzić czasochłonną metodą PCR.

    Test, to nie lek na koronawirusa. Dziś może być ujemny, a jutro już pozytywny

    Testować musimy, żeby określić źródła ognisk. Nie dajmy się jednak zwariować, przetestowanie całej populacji jest niemożliwe. Nie mamy nieskończonych zasobów zarówno materialnych jak i ludzkich, a jak już wcześniej wspomniałam, jest okienko od zakażenia, w czasie którego wynik może być fałszywie ujemny. Własnie dlatego tak ważna jest w tej chwili izolacja. Nie musisz wychodzić, siedź w domu. Zwiększysz szansę na to, że nasza i tak przeciążona służba zdrowia będzie w czasie epidemii wydolna. Nie zatajaj żadnych kontaktów przed lekarzem. Masz nałożony obowiązek kwarantanny? Siedź na tyłku i nie wychodź z domu. Apel do młodzieży: nie organizujcie sobie spotkań towarzyskich w parkach, nad jeziorami, czy rzekami. To jest czas, kiedy wszyscy musimy być zdyscyplinowani. Zostając w domu, zmniejszasz szansę na zakażenie osób, które muszą wyjść. Służba zdrowia, policja, kurierzy, pracownicy sklepów spożywczych, aptek, etc. muszą świadczyć nam strategiczne usługi. Przyłączam się do apelu #zostanwdomu. Bądźcie zdrowi i siedźcie w domu!

    0 0 vote
    Article Rating